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支原體qPCR陰性對照擴增曲線翹尾的原因

發(fā)布時間： 2025-05-22　　點擊次數(shù)： 299次

標(biāo)準(zhǔn)擴增曲線：呈S型，分為基線期、指數(shù)起始期、指數(shù)擴增期和平臺期，且要求拐點清楚，整體平行性好，基線平而無上揚現(xiàn)象。
陰性對照擴增曲線翹尾：是指ct值在35之后（判讀臨界點）出現(xiàn)擴增。

小編根據(jù)自己的經(jīng)驗總結(jié)如下原因：
1、環(huán)境污染：如實驗室經(jīng)常稀釋陽性樣本或出現(xiàn)高濃度陽性樣本，會污染環(huán)境造成氣溶膠污染。
解決方案：（1）建議在 qPCR 反應(yīng)板上陽性對照的排布應(yīng)遠離待測樣本和陰性對照。
（2）使用不同的移液器添加陽性對照與待測樣本、陰性對照，并使用帶濾芯的槍頭進行加樣，加樣順序是：陰性對照，待測樣本，陽性對照。
（3）陽性樣本分區(qū)操作，設(shè)置專門的陽性操作區(qū)。
2、無菌操作不到位：環(huán)境中存在大量支原體，如人口腔中存在口腔支原體、土壤中存在發(fā)酵支原體。如果無菌操作不規(guī)范，都會引入污染。
解決方案：（1）進入無菌室操作前，佩戴一次性袖套，穿專用工作服、一次性帽子及鞋套、口罩。工作服、帽及鞋套、口罩，應(yīng)放在無菌室緩沖間，工作前經(jīng)紫外線消毒后使用。
（2）從槍頭盒中取出槍頭時，尖部不能觸及外露部位及離心管和管架邊。
（3）操作中，不能在樣品上方翻轉(zhuǎn)瓶蓋，袖口不能掠過樣品上方。
（4）換下的專用實驗服，進行紫外線，一次性鞋套額帽子扔進垃圾桶。
（5）無菌室和緩沖間定期大掃除，保持整潔。
（6）每周用核酸清除劑清潔無菌操作臺、傳遞窗和桌面，實驗垃圾建議當(dāng)場封閉并丟棄。
（7）實驗前用1% 84消毒液擦凈臺面及四周，放好需用的實驗器材及各種溶液，并用酒精棉球擦拭，更換干凈的管架。
3、試劑耗材污染：陽性移液槍未專用，直接加樣，易引起污染；槍頭、離心管、PCR管等耗材，不是無菌或暴露在陽性環(huán)境中，也易引入污染。
解決方案：（1）使用專用陽性移液槍加陽性樣本，同時設(shè)置陽性區(qū)。
（2）使用無菌耗材，耗材用完后封口，避免暴露在環(huán)境中。
（3）實驗室設(shè)立分區(qū)，可分為配液間（潔凈區(qū)）、樣本處理區(qū)、陽性區(qū)和核酸擴增區(qū)；不同分區(qū)的耗材和移液器勿交叉使用。
4、試劑盒在配制過程中污染：如果操作不當(dāng)，環(huán)境和耗材也會引入污染。
解決方案：可以通過試劑盒入庫前質(zhì)控檢測。
5、非特異性擴增：試劑盒凍融次數(shù)過多，導(dǎo)致引物探針斷裂。
解決方案：試劑避免反復(fù)多次凍融，可分裝儲存。

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